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核酸萃取 PCR 原理 基因定序 淺談基因檢測

 

核酸萃取(DNA Isolation)

  人類遺傳物質(基因)存在於細胞核中的DNA(圖一)。人類基因體大約含有30 億個鹼基,這些鹼基共同組成25000 基因,調控人體不同的生理反應。人與人間的基因相似度極高(約99.9%),只有不到0.1%的差異,卻可以造就出完全不同個體。人體不同組織的細胞其所含的DNA 都是相同的,並不會因為組織差異而有所不同,也就是說不論是從血液、口腔黏膜、毛髮或是人類其它的細胞組織所萃取出來的DNA 都是相同的,並不會因為檢體來源不同而有所改變。


  萃取純化DNA 的方法很多,目前最常見的方法分成兩類:管柱萃取純化法(Column Purification)與試劑萃取純化法(Reagents Purification)。在試劑萃取純化法方面,又分成兩類:有機溶劑萃取法與非有機溶劑萃取法。每種萃取方法各有其優點、缺點,然而,由於有機溶劑具腐蝕毒性,人員在操作安全上需特別小心,同時其廢棄物的處理亦較為煩瑣,因此,使用非有機溶劑萃取方法已慢慢成為趨勢。


1. 管柱萃取純化法(Column Purification):其原理主要是先以陰離子性清潔劑將細胞打破,並使蛋白質變性,以抑制 DNase 的活性,隨後加入蛋白?(Proteinase K)讓DNA 上的蛋白質解離,以增加DNA 產率。接著將此含有DNA 的混合物滴入純化管柱中,DNA 會與純化管柱中的過濾膜結合,其它物質不會與過濾膜結合而流出,最後再利用緩衝液將過濾膜上的DNA 洗提使其流出。(圖二)


2. 有機溶劑萃取純化法(Organic Sorvant Reagents Purification):其原理主要是利用有機溶劑:酚(Phenol)、氯仿(Chloroform)將細胞溶解,經過超高速離心,再利用DNA 會分佈於水相層的原理,將DNA 分離出來,經過酒精清洗沉澱,最後回溶於緩衝液中。


3. 非有機溶劑萃取純化法(Non-Organic Sorvant Reagents Purification):其原理主要是先以陰離子性清潔劑將細胞打破,並使蛋白質變性,以抑制DNase 的活性,並加入蛋白?(Proteinase K)讓DNA 上的蛋白質解離,以增加DNA 產率。接著再以鹽類沉澱方法去除蛋白質。萃取到的DNA 以酒精沉
澱法濃縮,並回溶於緩衝溶液中保留。完成DNA 萃取與純化後,需要進一步作品質上定性及定量的控制分析(Quality Control Assay),包括:瓊膠電泳分析(Agarose Gel Electrophoresis Analysis)與紫外光吸光值分析(UV Absorption Analysis)。


1. 瓊膠電泳分析:利用DNA 分子大小與帶負電荷與的特性,當其通過洋菜瓊膠所形成的孔篩時,DNA 會往陽極方向移動,分子越小移動速度越快,分子越大移動速度越慢。如果檢體組織細胞中的DNA 分子完整無缺,未被破壞,利用上述之技術方法分離純化所得的DNA 分子大小大約為23000 bp,透過此項檢測可以得知DNA 是否保持完整、或是有被分解的現象。


2. 紫外光吸光值分析:利用DNA 分子在波長260nm 時有吸光、蛋白質在波長280nm 有吸光的特性,分析DNA 的濃度與純度。當波長260nm 的吸光值為1 時,DNA 的濃度為50ug/mL,依此類推,若波長260nm 的吸光值為0.5 時,DNA的濃度則為25ug/mL。DNA 的純度可利用波長260nm/波長280nm 的比值來評估,當A260/A280 的比值越大,代表蛋白質汙染越低、DNA 純度越高。當A260/A280 的比值介於1.7~2.0 時,則表示此DNA 的品質相當高!若低於此值,表示蛋白質未被去除乾淨。


以口腔黏膜細胞萃取DNA 為例。將檢體送入DNA分離實驗室,在第2 級生物安全無菌操作台內進行DNA 萃取步驟。


1. 細胞分解(Cell Lysis):利用含陰離子性清潔劑的細胞分解液(Cell Lysis Buffer)將細胞徹底地打破,讓細胞核中的DNA暴露到分解液中。(圖三)


2. 蛋白?(Proteinase K)水解:蛋白?K 可以將蛋白質水解,其中,它會水解與DNA 結合的組蛋白(Histone),使DNA 完全裸露出來,因此可以大提高PCR 的成功率。此酵素作用溫度為55℃,作用時間約需1 小時以上,作用時間越久(1 小時~隔夜)DNA產率越高。(圖四)


3. 蛋白質沉澱(Protein Precipitation):利用含有高濃度鹽類的蛋白質沉澱液,經過高速離心(約16000x g)將蛋白質與DNA 兩者分離。(圖五)
4. DNA 沉澱(DNA Precipitation):利用異丙醇將DNA 離心沉澱出來,可加入肝醣(Glycogen)增加DNA 產率。


5. 酒精清洗:利用70%的乙醇清洗DNA 分子,去除多餘鹽類。( 圖六 )


6. DNA 乾燥:最後將純化的DNA 進行真空乾燥,呈現半透明凝膠狀即可,千萬別過度乾燥,以免影響DNA 回溶(Re-suspend)。( 圖七 )


7. DNA 回溶(Re-suspend):加入適量體積的鹼性緩衝液(TrisBuffer,pH8.0),並且適當的混合使DNA 分子均勻地分散在其中,可用65℃水浴幫助DNA 回溶。( 圖八)


8. DNA 電泳定性分析。( 圖九 )


9. DNA 定量分析。( 圖十)


10. DNA 保存於-80℃冰箱中。